Aнти-инфламаторна и имуномодулаторна својства дапсона на хуманим ћелијама периферне крви, in vitro/

Abstract

Дапсон је хемијски аналог сулфапиридина, синтетисан почетком XX века. Због свог бактериостатског дејства, првобитно је коришћен као антибиотик. Као антагониста пара-аминобензоичне киселине, дапсон инхибира синтезу дихидрофолне киселине, која је неопходна за раст бактерија. Већ деценијама се користи као терапија првог избора у лечењу лепре. Такође, примењује се у лечењу инфекција Pneumocystis jirovecii и Toxoplasma gondii код пацијената са AIDS-ом. Дапсон је такође показан као ефикасан антималарик. Недуго након његовог увођења у клиничку праксу, уочена су и његова анти-инфламаторна својства. Као анти-инфламаторни агенс, дапсон се користи у лечењу хроничних запаљенских обољења коже, познатих као неутрофилне дерматозе, које се карактеришу прекомерном инфилтрацијом неутрофилних и еозинофилних гранулоцита. Поред тога, користи се као допунска терапија за лечење других кожних и системских обољења. Међутим, и даље не постоје убедљиви докази о утицају дапсона на адаптивни имунски одговор. Доступна сазнања о анти-инфламаторним својствима дапсона су оскудна, што отежава потпуно разумевање терапијског одговора код пацијената оболелих од неутрофилних дерматоза. Разјашњење непотпуне слике о утицају дапсона на функцију неутрофилних гранулоцита, као и на ћелије адаптивног имунског одговора, представља основни научни проблем овог истраживачког пројекта. Циљеви истраживања ове докторске дисертације били су да се испита цитотоксичност дапсона на моделу хуманих неутрофилних гранулоцита и дендритских ћелија моноцитног порекла (moDC) периферне крви, као и ефекат нетоксичних доза дапсона на функционалне и фенотипске карактеристике неутрофилних гранулоцита и moDC. У истраживању су коришћени неутрофилни гранулоцити периферне крви и moDC добровољних даваоца. За добијање дендритских ћелија моноцитног порекла (moDCs) примењен је протокол базиран на факторима стимулације гранулоцитних/макрофагних колонија (GM-CSF) и интерлеукина (IL-4). Цитотоксичност дапсона на овим ћелијским моделима утврђена је методом проточне цитометрије. Продукција слободних радикала кисеоника одређена је методом хемилуминисценције луминола код неутрофилних гранулоцита стимулисаних са форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA), N-формилметионин леуцин фенилаланин (fMLP), калцијум јонофор (CaI) и цитокинима фактором некрозе тумора (TNF-α) алфа и интерлеукином 8 (IL-8), док је интензитет ослобађања ванћелијских неутрофилних замки (NETоза) мерен методом флуоресценције боје SytoxGreen код PMA и CaI стимулисаних неутрофилних гранулоцита. Фенотипске карактеристике су утврђене методом проточне цитометрије код неутрофилних гранулоцита стимулисаних са fMLP и цитокинима (TNF-α и IL-8), moDC и ко-културама moDC и Т лимфоцита. (енгл. specific sandwich enyzmelinked immunosorbent assay) специфични сандвич имуносорбентни тест (ELISA) метода коришћена је за мерење продукције цитокина у културама неутрофилних гранулоцита и moDCs, као и у ко-културама moDCs и Т лимфоцита. Резултати показују да је дапсон инхибирао продукцију ROS-ова и IL-8 у културама неутрофилних гранулоцита стимулисаних са PMA, fMLP, CaI и цитокинима (TNF-α и IL-8), као и NETозу у културама неутрофилних гранулоцита стимулисаних са PMA и CaI. Такође, дапсон је смањио продукцију IL-8 у културама стимулисаним са fMLP и TNF-α + fMLP. Дапсон је такође снизио експресију површинских маркера: CD11b/CD18, CD66 и CD89, истовремено стимулишући експресију маркера CD16, CD32, CD62L, CD89 и CD181 на неутрофилним гранулоцитима, што доводи до смањења њихове активације и ефекторске функције при стимулацији са fMLP-ом и цитокинима (TNF-α и IL-8). На моделу незрелих moDC, диференцираних од моноцита у присуству GM-CSF и IL-4, дапсон је умањио експресију CD209. Дапсон је такође утицао на сазревање ових ћелија индукованих LPS/IFN-γ, инхибирајући експресију хемокинских рецептора CCR2 и CCR7 и ко-стимулаторног молекула CD86, као и експресију толерогених маркера (PD-L1, IDO-1, TGF-β и IL-10). У истом контексту, дапсон је смањио продукцију про-инфламаторних цитокина (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12 и IL-23), док је инхибирао продукцију анти-инфламаторног цитокина TGF-β и стимулисао продукцију IL-27. У ко-културама moDC и Т лимфоцита, moDC диференциране у присуству дапсона показале су смањен капацитет за поларизацију Th одговора у правцу Th1, Th2, Th17 и Treg ћелија, уз смањен капацитет за индукцију FoxP3+ Treg ћелија. Тиме се потврђује да дапсон има значајан утицај на функцију неутрофилних гранулоцита и дендритских ћелија моноцитног порекла, што указује на његове потенцијалне терапијске примене у лечењу запаљенских обољења и модулацији имунског одговора.

Dapsone is a chemical analogue of sulfapyridine, synthesized in the early 20th century. Due to its bacteriostatic action, it was initially used as an antibiotic. As an antagonist of para-aminobenzoic acid, dapsone inhibits the synthesis of dihydrofolic acid, which is essential for bacterial growth. For decades, it has been used as a first-line therapy in the treatment of leprosy. It is also used to treat infections caused by Pneumocystis jirovecii and Toxoplasma gondii in AIDS patients. Dapsone has also been shown to be an effective antimalarial. Shortly after its introduction into clinical practice, its anti-inflammatory properties were observed. As an anti-inflammatory agent, dapsone is used in the treatment of chronic inflammatory skin diseases, known as neutrophilic dermatoses, which are characterized by excessive infiltration of neutrophils and eosinophils. In addition, it is used as an adjunctive therapy for the treatment of other skin and systemic disorders. However, convincing evidence regarding the impact of dapsone on the adaptive immune response is still lacking. Available knowledge on the anti-inflammatory properties of dapsone is limited, making it difficult to fully understand the therapeutic response in patients with neutrophilic dermatoses. Clarifying the incomplete understanding of the impact of dapsone on the function of neutrophilic granulocytes, as well as on the cells of the adaptive immune response, is the primary scientific problem of this research project. The aims of this doctoral dissertation were to investigate the cytotoxicity of dapsone on a model of human neutrophil granulocytes and monocyte-derived dendritic cells (moDCs) from peripheral blood, as well as the effect of non-toxic doses of dapsone on the functional and phenotypic characteristics of neutrophil granulocytes and moDCs. The study used peripheral blood neutrophil granulocytes and moDCs from healthy volunteers. Monocyte-derived dendritic cells (moDCs) were obtained using a protocol based on granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-4 (IL-4). Cytotoxicity of dapsone on these cell models was assessed by flow cytometry. Production of reactive oxygen species (ROS) was measured by luminol chemiluminescence in neutrophils stimulated with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), calcium ionophore (CaI), and cytokines tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukin-8 (IL-8). The intensity of neutrophil extracellular trap (NET) release (NETosis) was determined by fluorescence using SytoxGreen dye in PMA- and CaI-stimulated neutrophils. Phenotypic characteristics were analyzed by flow cytometry in neutrophils stimulated with fMLP and cytokines (TNF-α and IL-8), in moDCs, and in moDC-T lymphocyte co-cultures. Specific sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure cytokine production in neutrophil and moDC cultures, as well as in moDC and T lymphocyte co-cultures. The results showed that dapsone inhibited the production of ROS and IL-8 in neutrophil cultures stimulated with PMA, fMLP, CaI, and cytokines (TNF-α and IL-8), as well as NETosis in neutrophil cultures stimulated with PMA and CaI. Dapsone also reduced IL-8 production in cultures stimulated with fMLP and TNF-α + fMLP. Furthermore, dapsone decreased the expression of surface markers CD11b/CD18, CD66, and CD89, while simultaneously stimulating the expression of CD16, CD32, CD62L, CD89, and CD181 on neutrophils, leading to reduced activation and effector function upon stimulation with fMLP and cytokines (TNF-α and IL-8). In the immature moDC model, differentiated from monocytes in the presence of GM-CSF and IL-4, dapsone reduced the expression of CD209. Dapsone also influenced the maturation of these cells induced by LPS/IFN-γ, inhibiting the expression of chemokine receptors CCR2 and CCR7, the co-stimulatory molecule CD86, and tolerogenic markers (PD-L1, IDO-1, TGF-β, and IL-10). In the same context, dapsone decreased the production of pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, and IL-23), while inhibiting the production of the anti-inflammatory cytokine TGF-β and stimulating the production of IL-27. In moDC and T lymphocyte co-cultures, moDCs differentiated in the presence of dapsone showed a reduced capacity to polarize Th responses toward Th1, Th2, Th17, and Treg cells, with a decreased capacity to induce FoxP3+ Treg cells. These findings confirm that dapsone has a significant impact on the function of neutrophil granulocytes and monocyte-derived dendritic cells, indicating its potential therapeutic applications in treating inflammatory diseases and modulating immune responses.