Имуномодулацијска својства природних целулозних нанокристала

Abstract

Наноцелулоза (NC) привлачи доста пажње последњих неколико година, посебно када је у питању биомедицинска примјена. У том смислу су од значаја њена примјена у виду антибактеријског средства, потом у областима ткивног инжињеринга, зарастања рана, доставе лијекова и терапије тумора. Међутим, имуномодулацијска својства NC, а посебно се то односи на целулозне нанокристале (CNC), су до сада недовољно испитана. Оно што CNC издваја у односу на друге биоматеријале, укључујући и друге типове NC, су веома пожељна физичко-хемијска својства, доступност извора и јефтин процес производње. Циљеви истраживања су били да се: испита цитотоксичност CNC на моделу хуманих мононуклеарних ћелија периферне крви (PBMNC); одреди дозно зависни ефекат нецитотоксичних концентрација CNC на функционална својства PBMNC; анализира ефекат нецитотоксичних концентрација CNC на диферентовање моноцита периферне крви у дендритске ћелије (moDC) и њихово сазријевање; испита ефекат нецитотоксичних концентрација CNC на функционална свосјства moDC. На моделу PBMNC је анализирана цитотоксичност CNC и модулација пролиферације и продукције цитокина индукованих поликлонским стимулатором. Интернализација CNC је проучавана на истом моделу флуоресцентном микроскопијом након припреме цитоспин препарата. Имуномодулацијски ефекти CNC на антиген презентујуће ћелије (APC) су испитивани на моделу moDC и алогених Т лимфоцита. Фенотипске карактеристике moDC и Т ћелија су одређиване проточном цитометријом. Функцијска карактеризација moDC и Т ћелија је одређивана тестом алогене мијешане леукоцитне реакције и анализом цитокина. Резултати су показали да нецитотоксичне дозе CNC (≤ 400 μg/ml) поред супресије пролиферације PBMNC, инхибирају и продукцију TNF-α, IFN-γ, IL-2 и IL-1β од стране PBMNC. Са друге стране показана је стимулација продукције IL-6, IL-17 и IL-10 у културама ових ћелија. Анализа интеракције CNC и PBMNC је утврдила да лимфоцити не интернализују CNC за разлику од моноцита/макрофага и DC. CNC су смањили капацитет диференцијације moDC с обзиром на већу експресију CD14 и CD209, односно мању експресију CD1a од стране moDC диферентованих у присуству CNC у поређењу са контролним moDC. CNC су модификовали сазријевање moDC у присуству LPS/IFN-γ. Наиме, moDC диферентоване у присуству CNC су мање испољавале CD83 након стимулације LPS/IFN-γ у поређењу са контролним moDC. Са друге стране, ове ћелије су HLA-DR експримирале у већој мјери у односу на контролне moDC. Експресија CD86 и CD40 није била значајније модификована у поређењу са контролним moDC. Такође, показан је стимулативни ефекат CNC на толерогени потенцијал moDC. moDC диферентоване у присуству CNC су више испољавале толерогене маркере (PD-L1, ILT-3, IDO-1, IL-33 и IL-10) у поређењу са контролним moDC. Уочено је смањење концетрације IL-1β, IL-12 и IL-23, a повећање концентрације IL-10 и IL-27 у супернатантима култура moDC диферентованих у присуству CNC у односу на контролне moDC. moDC диферентоване у присуству CNC су усмјеравалe Th одговор у правцу Th2 и регулаторних Т ћелија (Treg), a инхибирaлe Th1 и Th17 поларизацију Т ћелија. Ови резултати јасно указују да CNC модулирају имунски одговор потенцирањем толерогених својстава DC. Имуномодулацијска својства CNC захваљујући којима CNC посједују изузетан имунотерапијски потенцијал, могу бити искориштена не само на пољу ткивног инжињеринга већ и за дизајнирање нових платформи у терапији болести у којима је неопходно постићи добро контролисану и DC-посредовану индукцију толеранце.

Nanocellulose (NC) has attracted considerable attention in recent years, particularly in the field of biomedical applications. In that sense, its aplication as an antibacterial agent, as well as in tissue engineering, wound healing, drug delivery and tumor therapy is of significant importance. However, the immunomodulatory properties of NC, specifically cellulose nanocrystals (CNC), have not been investigated thoroughly. CNC possess highly desirable physicochemical properties, source availability and a cost-effective production process that sets them apart from other biomaterials, including other types of NC. The research objectives were to: examine the cytotoxicity of CNC on a model of human peripheral blood mononuclear cells (PBMNC); determine the dose-dependent effect of non-cytotoxic concentrations of CNC on the functional properties of PBMNC; analyze the effect of non-cytotoxic concentrations of CNC on the differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells (moDC) and their maturation; investigate the effect of non-cytotoxic concentrations of CNC on the functional properties of moDC. Cytotoxicity of CNC and modulation of proliferation and cytokine production induced by polyclonal stimulator were analyzed on the PBMNC model.. The internalization of CNC was studied on the same model by fluorescent microscopy after preparation of cytospin preparations. The immunomodulatory effects of CNC on antigen-presenting cells (APC) were examined on the moDC and allogenic T cells model. The phenotypic characteristics of moDC and T cells were determined by flow cytometry. The functional characterization of moDC and T cells was determined by the allogeneic mixed leukocyte reaction assay and cytokines analysis. The results showed that non-cytotoxic doses of CNC (≤ 400 μg/ml) not only suppressed PBMNC proliferation but also inhibited the production of TNF-α, IFN-γ, IL-2, and IL-1β by PBMNC. Analysis of the interaction between CNC and PBMNC revealed that lymphocytes did not internalize CNC, unlike monocytes/macrophages and DC. CNC reduced the differentiation capacity of moDC, as evidenced by higher expression of CD14 and CD209 and lower expression of CD1a by moDC differentiated in the presence of CNC compared to control moDC. CNC also modulated the maturation of moDC in the presence of LPS/IFN-γ. Specifically, moDC differentiated in the presence of CNC showed lower CD83 expression after LPS/IFN-γ stimulation compared to control moDC. In contrast, these cells expressed HLA-DR more than control moDC. The expression of CD86 and CD40 was not significantly modified compared to control moDC. Additionally, a stimulatory effect of CNC on the tolerogenic potential of moDC was demonstrated. moDC differentiated in the presence of CNC expressed higher level of tolerogenic markers (PD-L1, ILT-3, IDO-1, IL-33 and IL-10) compared to control moDC. A significant decrease in the concentration of IL-1β, IL-12, IL-23 and an increase in the concentration of IL-10 and IL-27 was detected in the supernatants of moDC cultures differentiated in the presence of CNC compared to control moDC. moDC differentiated in the presence of CNC directed the T-cell response towards Th2 and regulatory T cells (Treg) and inhibited Th1 and Th17 polarization of T cells.. These results clearly indicate that CNC modulates the immune response by enhancing the tolerogenic properties of DC. The immunomodulatory properties of CNC, which contribute to its exceptional immunotherapeutic potential, can be utilized not only in tissue engineering but also in the design of novel platforms for diseases where well-controlled and DC-mediated induction of tolerance is necessary.